提供商:         上海研謹生物
服務名稱:       凋亡因子Caspase-389實驗
規格:           實驗服務
價格：          500元
周期：          10天左右
收費標準/服務周期/提供結果:
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凋亡因子Caspase-389檢測實驗
 
Caspase3
Caspase是- -個在細胞凋亡過程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase3也稱CPP32, 是細胞凋亡過程中的一個關鍵酶，可以剪切procaspase2.6. 7和9，并可以直接特異性剪切許多caspase底物，包括PARP (poly(ADP-ribose) polymerase), ICAD (Inhibitor of caspase-activated Deoxyri- bonuclease), gelsolin和fodrin等。 這些由caspase 3介導的蛋白剪切是細胞凋亡分子機制的重要組成部分。caspase 3在細胞核凋亡過程中也起到了關鍵作用，包括染色質固
縮，DNA片段化等。同時caspase 3對細胞起泡(Cell blebbing)也起到關鍵作用。
檢測原理基于casepase 3可以催化底物AC-DEVD-pNA產生黃色的pNA(-itroaniline),從而可以通過測定吸光度來檢測caspase 3的活性。pNA在405nm附近有強吸收。參照黃色產物pNA制作的標準曲線，可以作為定量caspase 3酶活性的標準品。
 
Caspase-8
Caspase 8通常以酶原的形式存在，在細胞凋亡的信號轉導過程中被激活，Caspase 8被認為是細胞凋亡信號轉導過程中上游的caspase,在Fas-receptor和TNFR-1介導的細胞凋亡 過程中caspase 8被激活,形成一個由p18和p10組成的二聚體，進一步激活下游的caspase 4, caspase 6。caspase 9和caspase 10。本方法基于Caspase 8可以催化底物AC-IETD-pNA產生黃色的pNA (-nitraniline),從而可以通過測定吸光度來檢測Caspase 8的活性。pNA在405nm附近有強吸收。 檢測樣本的405nm OD值參照pNA制作的標準曲線，可以計算樣品的Caspase 8酶活性。
 
Caspase-9
Caspase 9也稱ICE-LAP6或Mch6,是細胞凋亡信號轉導過程中上游的caspase。線粒體釋放細胞色素c以后，caspase 9可以和細胞色素c以及Apaf1形成復合物，同時被激活。激活的caspase 9可以激活細胞凋的最關鍵酶caspase 3,從而促進后續的細胞凋亡信號。Caspase 9的激活可以通過磷酸化進行調控。
 
本方法基于Caspase 9可以催化底物Ac- LEHD -pNA產“生黃色的pNA (p-nitroaniline),從而可以通過測定吸光度來檢測
 
Caspase 9的活性。pNA在405nm附近有強吸收。檢測樣本的405nm OD值參照pNA制作的標準曲線，可以計算樣品的Caspase 9酶活性。
Caspase1
Caspase2
Caspase4
Caspase6
 
凋亡因子Caspase 3/8/9檢測樣本準備:
1)細胞樣品:取1x107個細胞(約1個T25的培養瓶細胞量) , 600g 4°C離心5分鐘收集細胞，小心吸除上清，PBS洗滌一次。吸取上清后，每管細胞樣品加入100u|裂解液重懸沉淀,冰浴裂解15分鐘。4°C 16,000g離心10-15分鐘， 把上清轉移到冰浴預冷的離心管中。立即測定caspase 3的酶活性或-70°C保存樣品。同時可以取少量樣品用Bradford法測定蛋白濃度，盡量使蛋白濃度達到1-3mg/ml.
2)組織樣品:約每10mg組織加入100ul裂解液，在冰浴上用玻璃勻漿器勻漿。然后把勻漿液轉移到1 .5ml)離心管中，冰浴再裂解5分鐘。4°C 16,000g離心10-15分鐘，把上清轉移到冰浴預冷的離心管中。立即測定caspase 3的酶活性或-70°C保存
樣品。同時可以取少量樣品用Bradford法測定蛋白濃度，盡量使蛋白濃度達到1-3mg/ml.
Caspase-3活性檢測標準曲線
 
實驗周期: 7-10個工作日內完成，重復檢測優惠。
客戶注意事項
1.抗體:事先咨詢上海研謹生物，明確抗體種屬以及是否有該抗體可使用。如無可由雙方協商而定，客戶自己購買提供或我公司代購;
2.標本收集與保存:
①組織樣品:新鮮組織放入液氮或-70度保存,組織不少于100mg (約綠豆大小) ;
②培養細胞:通過細胞計數取不少于000000個細胞于EP管，加入0.5ml生理鹽水或蛋白保護劑，混勻后保存于冰箱(-70°C，避免反復凍融) ;
③血液細胞標本:以抗凝管保存血樣或以淋巴細胞分離液分離細胞后加入0.5ml生理鹽水或蛋白保護劑，保存(-70°C可長期保存，避免反復凍融)
④血清或細胞培養液標本:離心去掉雜質后取上清入EP管，保存(以上4°C可保存15-20天，-70°C可長期保存，避免反復凍融)
3、樣本運輸:可選以下任何的一種方式寄送標本
①組織樣本、細胞樣本以干冰運輸或加入蛋白保護劑后加冰袋運輸;
②細胞樣本也可以直接快件寄送培養瓶(密封保證不污染，培養液不漏出,細胞不要長得太滿，50%左右,灌滿培養液) ;
③血清或上清液直接加冰袋寄送(密封保證液體不漏出，視路途遠近2-3天可到達)。
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